Nach weiteren intensiven Studien kann Vesalius als 28-Jähriger sein Lebenswerk vorlegen: De humani corporis fabrica (Über den Bau des menschlichen Körpers) erscheint 1543 bei Johannes Oporinus, dem berühmtesten Basler Drucker. Das Werk gilt als der schönste Druck der Officina Oporina. In diesem Zusammenhang sezierte und präpariert Vesalius 1543 in Basel den Leichnam eines geköpften Verbrechers. Dieses so genannte Vesal´sche Skelett ist das älteste erhalten Anatomiepräparat der Welt und heute noch im Anatomischen Museum Basel zu besichtigen.
Auf rund 700 Seiten, in sieben Büchern, fasst Vesalius sein Wissen zusammen, beschreibt Knochenbau, Muskeln, Adern, Nerven, Unterleib, Brusthöhle und Gehirn. Er zollt Galen Respekt, weist aber auch auf dessen Fehler hin. Berühmt wurde das Werk vor allem wegen seiner künstlerisch hochwertigen Illustrationen – nur noch übertroffen an Qualität und der Feinheit der Darstellung von Leonard da Vincis 1500 Sektionsskizzen, die allerdings erst 200 Jahre später publiziert wurden.
1544 beendet Vesalius seine wissenschaftliche Laufbahn, er wird Leibarzt der Habsburger (Karls V. und seines Sohnes, Philipp II.) am Hof in Madrid, erwirbt sich auch dort den Ruf eines ausgezeichneten Chirurgen und wird für seine Verdienst geadelt. 1563 tritt er eine Pilgerreise nach Jerusalem an und stirbt auf der Rückfahrt.
Vesalius gilt als der Gründer der modernen Anatomie. Er ersetzte Autoritätsglaube durch Empirie, sein anatomischer Atlas ist zugleich ein Glanzstück und Meisterwerk der Buchkunst seiner Zeit und ein Klassiker der Medizin. In seiner Bedeutung für die Medizin wird Vesalius oft verglichen mit Kopernikus´ Rolle für die Astronomie. Beider Hauptwerke erschienen im selben Jahr. (Kopernikus: De revolutionibus orbium coelestium, 1543).
Vesalius war nicht der erste, der anatomische Studien betrieb und Leichen sezierte. Noch vor Galen (129 – 199), dem bedeutendsten Anatom der Antike, führen Erasistratos von Keos (um 305 – 250 v. Chr.) und Herophilos von Chalkedon (um 325-255 v. Chr.), die beiden Hauptvertreter der alexandrinischen Schule, erste wissenschaftliche Obduktionen und Vivisektionen an Mensch und Tier durch. Auch Vesalius Zeitgenossen erforschten die Anatomie des Menschen. Vesalisus´ Werk ist aber in vielem kritisch und innovativ, seine systematische Art der Zergliederung der Leichen wird die Grundlage zur Gewinnung von Informationen über den Körperbau des Menschen. Er beschreibt zum ersten Mal exakt den Blutkreislauf.
Der Titelholzschnitt zeigt eine gut besuchte öffentliche Anatomiestunde. Die architektonische Kulisse erinnert an die „anatomischen Theater“ der medizinischen Hörsäle der Zeit. Oben mittig das Familienwappen mit den drei Wieseln. Auf einem schmalen Podest steht Vesalius in der Bildmitte neben einem weiblichen Leichnam. Er erläutert den Uterus, die linke Hand dozierend erhoben, die rechte fährt mit einem Skalpell in die eröffnete Bauchhöhle; auf dem Tisch Stift, Tintenfass, ein Schwamm, ein Skalpell, ein Rasiermesser und eine Kerze. Die Zuschauer, auch Kleriker, drängen sich dicht heran, zwei mit Brille und Monokel bewehrt. Den Ehrenplatz in der Mitte nicht nimmt ein dozierender Professor ein, sondern ein auf der Brüstung sitzendes Skelett: Vesals Hinweis auf die Bedeutung der Osteologie als Grundlage der Anatomie.
